Сұйық хроматография шикізаттағы, аралық өнімдердегі, препараттардағы және орау материалдарындағы әрбір компоненттің құрамын және қоспаларды сынаудың негізгі әдісі болып табылады, бірақ көптеген заттардың сүйенетін стандартты әдістері жоқ, сондықтан жаңа әдістерді жасау сөзсіз. Сұйық фазалық әдістерді әзірлеуде хроматографиялық колонна сұйық хроматографияның өзегі болып табылады, сондықтан қолайлы хроматографиялық колонканы қалай таңдау маңызды. Бұл мақалада автор сұйық хроматография бағанасын үш аспектіден қалай таңдау керектігін түсіндіреді: жалпы идеялар, ойлар және қолдану аясы.
A. Сұйық хроматография бағандарын таңдаудың жалпы идеялары
1. Талданатын заттың физикалық және химиялық қасиеттерін бағалаңыз: химиялық құрылымы, ерігіштігі, тұрақтылығы (мысалы, тотығу/тотықсыздану/гидролизделу оңай ма), қышқылдық және сілтілік және т.б., әсіресе химиялық құрылым негізгі болып табылады. қасиеттерін анықтайтын фактор, мысалы, конъюгацияланған топ күшті ультракүлгін жұтылу және күшті флуоресценция;
2. Талдау мақсатын анықтаңыз: жоғары бөлу, жоғары бағана тиімділігі, қысқа талдау уақыты, жоғары сезімталдық, жоғары қысымға төзімділік, колоннаның ұзақ қызмет ету мерзімі, төмен шығындар және т.б. қажет пе;
- Сәйкес хроматографиялық бағанды таңдаңыз: хроматографиялық толтырғыштың құрамын, физикалық және химиялық қасиеттерін түсіну, мысалы, бөлшектердің өлшемі, кеуектер өлшемі, температураға төзімділік, рН төзімділігі, талданатын заттың адсорбциясы және т.б.
- Сұйық хроматография колонналарын таңдауда қарастырылатын мәселелер
Бұл тарауда хроматография колоннасының физикалық және химиялық қасиеттері тұрғысынан хроматографиялық бағанды таңдау кезінде ескерілетін факторлар талқыланады. 2.1 Толтырғыш матрицасы
2.1.1 Силикагель матрицасы Сұйық хроматография колонналарының көпшілігінің толтырғыш матрицасы силикагель болып табылады. Толтырғыштың бұл түрі жоғары тазалыққа, төмен бағаға, жоғары механикалық беріктікке ие және топтарды өзгерту оңай (мысалы, фенилдік байланыс, аминобайланыс, цианобайланыс және т.б.), бірақ ол төзімді рН мәні мен температура диапазоны шектеулі: Көптеген силикагельдік матрицалық толтырғыштардың рН диапазоны 2-ден 8-ге дейін, бірақ арнайы модификацияланған силикагельмен байланыстырылған фазалардың рН диапазоны 1,5-тен 10-ға дейін кең болуы мүмкін, сонымен қатар төмен рН кезінде тұрақты, арнайы модификацияланған силикагельмен байланыстырылған фазалар бар, рН 1-ден 8-ге дейін тұрақты болып табылатын Agilent ZORBAX RRHD тұрақты байланысы-C18 сияқты; Силикагель матрицасының жоғарғы температура шегі әдетте 60 ℃, ал кейбір хроматография бағандары жоғары рН кезінде 40 ℃ температураға шыдай алады.
2.1.2 Полимер матрицасы Полимерлі толтырғыштар негізінен полистирол-дивинилбензол немесе полиметакрилат болып табылады. Олардың артықшылықтары кең рН диапазонына шыдай алады – оларды 1-ден 14-ке дейінгі диапазонда қолдануға болады және олар жоғары температураға төзімді (80 ° C-тан жоғары болуы мүмкін). Кремний диоксиді негізіндегі C18 толтырғыштарымен салыстырғанда, толтырғыштың бұл түрі күшті гидрофобтылыққа ие және макрокеуекті полимер белоктар сияқты үлгілерді бөлуде өте тиімді. Оның кемшіліктері кремнезем негізіндегі толтырғыштарға қарағанда колоннаның тиімділігі төмен және механикалық беріктігі әлсіз. 2.2 Бөлшектердің пішіні
Қазіргі заманғы HPLC толтырғыштарының көпшілігі сфералық бөлшектер болып табылады, бірақ кейде олар дұрыс емес бөлшектер болып табылады. Сфералық бөлшектер төменгі баған қысымын, жоғары бағана тиімділігін, тұрақтылықты және ұзақ қызмет ету мерзімін қамтамасыз ете алады; тұтқырлығы жоғары жылжымалы фазаларды (мысалы, фосфор қышқылы) пайдаланған кезде немесе үлгі ерітіндісі тұтқыр болған кезде, біркелкі емес бөлшектердің меншікті бетінің ауданы үлкенірек болады, бұл екі фазаның толық әрекетіне қолайлырақ, ал бағасы салыстырмалы түрде төмен. 2.3 Бөлшектердің мөлшері
Бөлшектердің өлшемі неғұрлым аз болса, бағананың тиімділігі соғұрлым жоғары және бөлу жоғарырақ, бірақ жоғары қысымға төзімділік соғұрлым нашар. Ең жиі қолданылатын баған 5 мкм бөлшектер өлшемі бағанасы; егер бөлу талабы жоғары болса, 1,5-3 мкм толтырғышты таңдауға болады, бұл кейбір күрделі матрицалық және көп компонентті үлгілерді бөлу мәселесін шешуге қолайлы. UPLC 1,5 мкм толтырғыштарды пайдалана алады; 10 мкм немесе одан да үлкен бөлшектердің өлшемді толтырғыштары көбінесе жартылай дайындық немесе препараттық бағандар үшін қолданылады. 2.4 Көміртек құрамы
Көміртек құрамы силикагельдің бетіндегі байланысқан фазаның үлесін білдіреді, ол беттің нақты ауданына және байланыстырылған фазалық қамтуға байланысты. Көміртектің жоғары мөлшері жоғары бағана сыйымдылығын және жоғары ажыратымдылықты қамтамасыз етеді және жиі жоғары бөлуді қажет ететін күрделі үлгілер үшін қолданылады, бірақ екі фаза арасындағы ұзақ өзара әрекеттесу уақытына байланысты талдау уақыты ұзақ; төмен көміртекті хроматографиялық бағандардың талдау уақыты қысқа болады және әртүрлі таңдағыштықты көрсете алады және жиі жылдам талдауды қажет ететін қарапайым үлгілер мен жоғары сулы фаза жағдайларын қажет ететін үлгілер үшін пайдаланылады. Жалпы алғанда, C18 көміртегінің мөлшері 7%-дан 19%-ға дейін ауытқиды. 2.5 Кеуектер мөлшері және меншікті бетінің ауданы
HPLC адсорбциялық ортасы кеуекті бөлшектер болып табылады және өзара әрекеттесулердің көпшілігі кеуектерде жүреді. Сондықтан молекулалар адсорбцияланатын және бөлінетін тесіктерге енуі керек.
Кеуектің мөлшері мен бетінің нақты ауданы бір-бірін толықтыратын екі ұғым. Кішкентай кеуектер көлемі үлкен үлестік аумақты білдіреді және керісінше. Үлкен спецификалық бет ауданы үлгі молекулалары мен байланысқан фазалар арасындағы өзара әрекеттесуді ұлғайта алады, ұстап қалуды жақсартады, үлгі жүктемесін және баған сыйымдылығын арттырады және күрделі компоненттерді бөледі. Толық кеуекті толтырғыштар толтырғыштардың осы түріне жатады. Бөлу талаптары жоғары адамдар үшін үлкен спецификалық беті бар толтырғыштарды таңдау ұсынылады; кішігірім меншікті бет ауданы кері қысымды төмендетеді, бағанның тиімділігін арттырады және градиентті талдау үшін қолайлы тепе-теңдік уақытын қысқартады. Толтырғыштардың бұл түріне өзек-қабық толтырғыштары жатады. Бөлінуді қамтамасыз ету үшін талдау тиімділігі жоғары талаптары барлар үшін шағын меншікті беті бар толтырғыштарды таңдау ұсынылады. 2.6 Кеуек көлемі және механикалық беріктігі
Кеуек көлемі, сондай-ақ «кеуек көлемі» деп те аталады, бірлік бөлшекке келетін бос көлемнің өлшемін білдіреді. Ол толтырғыштың механикалық беріктігін жақсы көрсете алады. Кеуек көлемі үлкен толтырғыштардың механикалық беріктігі саңылау көлемі аз толтырғыштарға қарағанда біршама әлсіз. Кеуек көлемі 1,5 мл/г-ден аз немесе оған тең толтырғыштар негізінен HPLC бөлу үшін пайдаланылады, ал кеуек көлемі 1,5 мл/г асатын толтырғыштар негізінен молекулалық алып тастау хроматографиясы және төмен қысымды хроматография үшін қолданылады. 2.7 Төменгі мөлшерлеме
Қаптау қосылыстар мен ашық силанол топтары арасындағы өзара әрекеттесу нәтижесінде пайда болатын қалдық шыңдарын азайтуы мүмкін (мысалы, сілтілі қосылыстар мен силанол топтары арасындағы иондық байланыс, Ван-дер-Ваальс күштері және қышқыл қосылыстар мен силанол топтары арасындағы сутектік байланыстар), осылайша бағанның тиімділігі мен шыңның пішінін жақсартады. . Қақпағы жоқ байланыстырылған фазалар, әсіресе полярлық үлгілер үшін, жабылған байланыстырылған фазаларға қатысты әртүрлі селективтілікті тудырады.
- Әртүрлі сұйық хроматографиялық бағандарды қолдану аясы
Бұл тарауда кейбір жағдайлар арқылы сұйық хроматографиялық бағандардың әртүрлі түрлерінің қолдану аясы сипатталады.
3.1 Кері фазалық C18 хроматографиялық баған
C18 бағаны ең көп қолданылатын кері фазалық баған болып табылады, ол көптеген органикалық заттардың мазмұны мен қоспалық сынақтарына жауап бере алады және орташа полярлы, әлсіз полярлы және полярлы емес заттарға қолданылады. C18 хроматографиялық бағанының түрі мен спецификациясы арнайы бөлу талаптарына сәйкес таңдалуы керек. Мысалы, жоғары бөлу талаптары бар заттар үшін 5 мкм*4,6 мм*250 мм спецификациялар жиі пайдаланылады; күрделі бөлу матрицалары және ұқсас полярлығы бар заттар үшін 4 мкм*4,6 мм*250 мм спецификациясы немесе бөлшектердің кішірек өлшемдері қолданылуы мүмкін. Мысалы, целекоксиб API құрамындағы екі генотоксикалық қоспаны анықтау үшін автор 3 мкм*4,6 мм*250 мм бағананы пайдаланды. Екі заттың бөлінуі 2,9-ға жетуі мүмкін, бұл тамаша. Сонымен қатар, бөлуді қамтамасыз ету жағдайында, егер жылдам талдау қажет болса, 10 мм немесе 15 мм қысқа баған жиі таңдалады. Мысалы, автор пиперакин фосфат API құрамындағы генотоксикалық қоспаны анықтау үшін LC-MS/MS қолданған кезде 3 мкм*2,1 мм*100 мм баған пайдаланылды. Қоспа мен негізгі компонент арасындағы айыру 2,0 болды, ал үлгіні анықтау 5 минутта аяқталуы мүмкін. 3.2 Кері фазалық фенил бағанасы
Фенил бағанасы да кері фазалық бағанның түрі болып табылады. Бағананың бұл түрі хош иісті қосылыстар үшін күшті селективтілікке ие. Кәдімгі C18 бағанымен өлшенетін ароматты қосылыстардың реакциясы әлсіз болса, фенил бағанасын ауыстыру мүмкіндігін қарастыруға болады. Мысалы, мен celecoxib API жасап жатқанда, сол өндірушінің фенил бағанымен өлшенген негізгі құрамдас жауап және бірдей сипаттама (барлығы 5 мкм*4,6 мм*250 мм) C18 бағанынан шамамен 7 есе көп болды. 3.3 Қалыпты фазалық баған
Кері фазалық бағанға тиімді қосымша ретінде қалыпты фазалық баған жоғары полярлы қосылыстар үшін қолайлы. Кері фазалық бағандағы 90%-дан астам сулы фазамен элюция кезінде шың әлі де өте жылдам болса және тіпті еріткіш шыңына жақын және онымен қабаттасатын болса, қалыпты фазалық бағанды ауыстыру мүмкіндігін қарастыруға болады. Бағананың бұл түріне гиликалық баған, амин бағанасы, циано бағанасы және т.б.
3.3.1 Хилик бағанасы Гилик бағаны әдетте полярлы заттарға реакцияны күшейту үшін гидрофильді топтарды байланыстырылған алкил тізбегіне енгізеді. Колоннаның бұл түрі қант заттарын талдау үшін қолайлы. Автор ксилоза мен оның туындыларының мазмұнын және соған байланысты заттарын жасау кезінде бағанның бұл түрін пайдаланған. Ксилоза туындысының изомерлері де жақсы бөлінуі мүмкін;
3.3.2 Амино бағанасы және циано бағанасы Амино бағанасы және циано бағанасы арнайы заттар үшін селективтілікті жақсарту үшін, тиісінше, байланыстырылған алкил тізбегінің соңында амин және циано модификацияларының енгізілуін білдіреді: мысалы, амин бағанасы жақсы таңдау болып табылады. қанттарды, амин қышқылдарын, негіздерді және амидтерді бөлу үшін; циано бағанасы конъюгацияланған байланыстардың болуына байланысты гидрогенизацияланған және гидрогенизацияланбаған құрылымдық ұқсас заттарды бөлгенде жақсырақ селективтілікке ие. Амин бағанасы мен циано бағаны жиі қалыпты фазалық баған мен кері фазалық баған арасында ауыстырылуы мүмкін, бірақ жиі ауыстырып тұру ұсынылмайды. 3.4 Хиральды баған
Хирал бағанасы, аты айтып тұрғандай, хиральды қосылыстарды бөлу және талдау үшін, әсіресе фармацевтика саласында қолайлы. Бағанның бұл түрін кәдімгі кері фаза және қалыпты фазалық бағандар изомерлерді бөлуге қол жеткізе алмаған кезде қарастырылуы мүмкін. Мысалы, автор 1,2-дифенилэтилендиаминнің екі изомерін бөлу үшін 5 мкм*4,6 мм*250 мм хиральдық колонканы пайдаланды: (1S, 2S)-1, 2-дифенилэтилендиамин және (1R, 2R)-1, 2. -дифенилэтилендиамин және олардың арасындағы бөлу шамамен 2,0-ге жетті. Дегенмен, хиральды бағандар бағандардың басқа түрлеріне қарағанда қымбатырақ, әдетте 1 Вт+/дана. Егер мұндай бағандарға қажеттілік болса, бөлімше жеткілікті бюджетті жасауы керек. 3.5 Ион алмасу бағаны
Ион алмасу колонналары зарядталған иондарды, мысалы, иондар, белоктар, нуклеин қышқылдары және кейбір қант заттарын бөлу және талдау үшін қолайлы. Толтырғыш түріне қарай олар катион алмасу бағаналы, анион алмасу бағанасы, күшті катионалмасу бағанасы болып бөлінеді.
Катион алмасу бағандарына кальций негізіндегі және сутегі негізіндегі колонналар жатады, олар негізінен аминқышқылдары сияқты катиондық заттарды талдауға жарамды. Мысалы, автор жуғыш ерітіндідегі кальций глюконаты мен кальций ацетатын талдау кезінде кальций негізіндегі колонналарды пайдаланды. Екі заттың да λ=210нм кезінде күшті реакциясы болды, ал бөліну дәрежесі 3,0-ге жетті; автор глюкозамен байланысты заттарды талдау кезінде сутегі негізіндегі бағандарды пайдаланды. Бірнеше негізгі байланысты заттар – мальтоза, мальтотриоза және фруктоза – дифференциалды детекторлар астында жоғары сезімталдыққа ие болды, анықтау шегі 0,5 промилледен төмен және бөлу дәрежесі 2,0-2,5 болды.
Анион алмасу колонналары негізінен органикалық қышқылдар мен галоген иондары сияқты анионды заттарды талдау үшін қолайлы; күшті катион алмасу бағандары ион алмасу қабілеті мен селективтілігі жоғары және күрделі үлгілерді бөлу және талдау үшін жарамды.
Жоғарыда айтылғандар автордың жеке тәжірибесімен біріктірілген бірнеше жалпы сұйық хроматография бағандарының түрлері мен қолдану ауқымдарына кіріспе ғана. Нақты қолдануда хроматографиялық бағандардың басқа да арнайы түрлері бар, мысалы, үлкен кеуекті хроматографиялық бағандар, шағын кеуекті хроматографиялық бағандар, ұқсастық хроматографиялық бағандар, көпмодалы хроматографиялық бағандар, ультра жоғары өнімді сұйық хроматографиялық бағандар (UHPLC), суперкритикалық сұйықтық хроматографиялық бағандар ( SFC) және т.б. Олар әртүрлі салаларда маңызды рөл атқарады. Хроматографиялық колоннаның нақты түрі үлгінің құрылымы мен қасиеттеріне, бөлу талаптарына және басқа мақсаттарға сәйкес таңдалуы керек.
Жіберу уақыты: 14 маусым 2024 ж